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种子消毒过程中的注意事项
一个
在种子消毒过程中，应谨慎使用75%的酒精。酒精渗透性强，消毒时间过长会直接影响种子的发芽率。因此，建议消毒时间不要超过1 min。
原始繁殖材料的消毒：
原组织培养外植体的消毒直接影响整个培养过程。
从户外采集的外植体需要消毒。首先要用自来水冲洗外植体，冲洗时间可根据采集部位的不同而定，一般为5 ~ 15分钟。在超净工作台中，常用的化学药品有70%的乙醇溶液、9%的次氯酸钠溶液和0.1 ~ 0.2%的氯化汞溶液，视实验材料而定。需要注意的是，氯化汞灭菌的外植体必须用无菌水冲洗6 ~ 8次。
如何处理植物组织培养中的污染？
2
植物组织培养中主要有三个污染源：真菌、细菌和组织培养中的其他污染。
在操作过程中，不可避免的会有菌落进入培养基或植物材料造成污染。操作不当也会增加污染的概率。
预防措施：通风、保持室内空气干燥、紫外线杀菌等。被污染的物品和被污染的培养基不应在培养室内近距离打开和清洗。
污染原因判断：
(1)培养基的污染
如果污染的真菌散布在培养基中，则可以确定污染是人为造成的。如培养基灭菌不彻底、开瓶时间过长、灭菌后存放时间过长、高温蒸汽灭菌器的温度、压力、时间设置不正确、过滤灭菌过程中滤膜孔径的选择、过滤灭菌器的灭菌处理、过滤灭菌操作等。这些都会影响培养基的灭菌效果。
措施：严格遵循实验要求和灭菌程序。
(2)外植体的污染
如果被污染的真菌生长在材料周围，5天后出现，说明是材料带内的内生菌。可能是接种设备消毒不彻底，接种时材料被污染；
如果细菌是从培养基下面生长出来的，那么它出现得更早，并且有从里到外的趋势，这就意味着污染是由切口造成的。原因可能是两个切口没有切掉，或者虽然切掉了，但是使用的器械携带了细菌。或者没有及时发现受污染的种苗，造成接种过程中的交叉污染；
措施：材料要精挑细选，减少污染。
(3)操作环节的污染
接种室是否清洁、干燥、密封，是否经常用紫外灯照射、甲醛熏蒸、70%酒精喷雾灭菌等。洁净工作台堆满物品，滤网久不换，导致净化能力降低；接种设备灭菌不彻底造成污染；操作不当等。
措施：每次接种前半小时，用20%新洁尔灭擦洗室内设备和台面，再用紫外线灯照射20 min，喷70%乙醇消毒。除了保证培养基、接种材料、器具的无菌外，接种时还要求严格的无菌操作。
(1)真菌污染后，如果孢子已经形成，必须高压灭菌并扔掉；如有细菌污染，只要及时发现，材料上部未感染部分切除转移，材料仍可使用。
(2)用抗生素等抗菌剂治疗。到目前为止，还没有发现哪种抗生素能对各种细菌都有效，而且常常影响植物材料的正常生长和分化。其他化学药品，虽然有的杀菌效果好，但往往容易造成盐害，不能使用。
外植体的选择
三
为了使接种后的诱导成功，选择的外植体应是幼嫩的、处于旺盛生长期的，并且选择的外植体体积应
用茎段进行组织培养是容易的。一般以植物的嫩茎段为外植体，切成0.5~1厘米长的小段进行接种，以保证每个茎段都有一个芽点和一片叶。将芽点垂直插入培养基凝胶中进行生根培养。
外植体接种的注意事项
五
接种前消毒。接种时使用的镊子、手术刀、剪刀等工具需要提前高温高压灭菌。提前10分钟开启洁净工作台，熄灭紫外线15 ~ 20分钟。操作人员应使用75%酒精棉球擦拭手、工作台和用具。手术刀和镊子应随时用酒精烧灼，然后冷却备用。
将外植体切在无菌培养皿或滤纸上，接种于培养基表面。注意瓶口倾斜靠近酒精灯的火焰。
褐变现象
六
不同的品种和生理状态导致不同的褐变状态。培养基中无机盐浓度过高和细胞分裂素水平过高会加重褐化。培养条件不当，如光照过强、温度过高、培养时间过长等。会增加多酚氧化酶的活性，从而加重外植体的褐化程度。
预防措施：
选择合适的外植体：选择生长旺盛的外植体可以明显减少褐化。
适宜的培养条件：无机盐组成、植物生长物质水平、适宜的温度、适时的继代培养都可以减少材料的褐变现象。
抗氧化剂的使用：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP等抗氧化剂可以有效地避免或减少许多外植体的褐变。此外，使用0.1% ~ 0.5%的活性炭对防止褐变效果明显。
连续转移：易褐变的材料可间隔12 ~ 24小时培养，再转移到新的培养基上，这样连续处理7 ~ 10天，褐变现象就会得到控制或大大减少。
玻璃化转变问题
七
当植物在离体条件下连续繁殖时，某些培养物的嫩茎和嫩叶会趋于半透明和水状，通常称为玻璃化。
它是玻璃化试管苗的一种生理障碍。试管苗生长缓慢，玻璃化的嫩茎不适合生根，繁殖系数下降。当培养基中细胞分裂素水平较高时，容易发生玻璃化。
愈伤组织的玻璃化主要表现在培养过程中愈伤组织疏松、易碎。或者一段时间后，叶片的愈伤组织周围会出现渍水，进而影响整个培养基。
预防措施：
在培养基中添加少量的聚乙烯醇、脱落酸等物质，降低培养基中细胞分裂素的含量和含氮化合物的量，选择低NH4水平的B5培养基可以在一定程度上减少玻璃化现象。
增加光照可以明显减少试管苗的玻璃化。在培养基中添加活性炭、马铃薯汁和间苯三酚能有效减少和防止玻璃化。
茎段附近的水浸、变色、坏死和干燥。
八
可能原因：表面杀菌剂过量、消毒时间过长、外植体选择不当(部位或时期)。
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改进措施：更换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，尝试其他部位，在生长初期取材。
胼胝生长过度且松散。
九
可能的原因：培养基中激素添加过量、培养室温度过高、矿物质等无机盐含量不当等。
改进措施：根据品种、组织、器官的不同，适当减少激素的用量，适当降低培养温度，调整无机盐(特别是铵盐)的含量，适当增加琼脂的用量，增加培养基的硬度，避免愈伤组织过度生长和疏松。
胼胝生长缓慢且紧密。
10
可能原因：过量使用细胞分裂素和生长素以及糖浓度过高。
改进措施：减少细胞分裂素的用量，调整细胞分裂素与生长素的比例，降低糖浓度。
愈伤组织变形，不能成苗。
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愈伤组织分化率低且畸形，分化出的芽多为叶芽或
改进措施：减少生长素的用量可以通过在分化培养时在培养基中添加GA3(浓度在0.5-2mg/L之间)，适当降低愈伤组织的培养温度来解决。
丛生苗太细，无法生根或移栽。
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可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当可能导致不定芽过多；温度过高，光照过短，光照强度不足；不及时转移和修剪，生长空间小。
改进措施：
减少细胞分裂素的用量，避免赤霉素；
延长光照时间，增强光照；
及时转移；
降低接种密度；
更换了透气密封膜等。
组织培养过程中会发生黄化。
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可能的原因：培养基中铁的含量不足，各种矿物质营养不均衡；培养环境通风不良，瓶内有害气体(乙烯、氨、甲醛)堆积等。会造成植物材料发黄脱落；激素配比不当；糖分摄入不足或长期不转移；pH值变化过大；培养温度不合适；光线不足等。
改进措施：
改善组织培养条件，在配制培养基过程中检查仪器设备是否准确；
降低组培苗的接种密度，及时转移培养物；
使用透气密封膜，提高瓶内通风；
适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度；
控制培养室的温度，适当增加光照。
木本植物组织培养再生苗不能生根。
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常用的1/2MS或1/2WPM基本可以满足要求。如果所有用于增殖的产品都正常生产，生根时出现叶片，只能用排除法分析。
首先看培养温度是否过高，使用瓶盖后透气性差，导致乙烯积累。其次，可以适当添加少量的促有丝分裂素，或者替代生长素，多种生长素混合使用。
培养基中为什么要添加糖作为碳源？
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碳为植物细胞提供能量来源，蔗糖比葡萄糖更能调节培养基中的渗透压。葡萄糖是微生物生长最常用的碳源。利用蔗糖作为培养基的碳源可以在一定程度上减少微生物污染。
生长素和蔗糖的浓度决定了愈伤组织中维管束的类型和数量。
植物原生质体制备材料
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植物原生质体的材料需要选择有活力的细胞和嫩组织。无菌试管苗的叶片、下胚轴、子叶、花药和愈伤组织(悬浮细胞)。
常用渗透压调节剂
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常用的调节原生质体渗透压的稳定剂主要有甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。渗透压一般为0.3 ~ 0.8摩尔/升.
组培苗移栽应注意的问题
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移栽前，打开三角瓶的密封膜，炼苗3 ~ 5天后取出幼苗，用流水冲洗根部培养基，然后移栽到装有灭菌蛭石的营养钵中。但注意不要直接把营养液倒在营养钵里(容易滋生细菌)，幼苗用透明塑料薄膜覆盖3 ~ 5天后再移栽到土里。
光照强度是怎么计算的？
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光强=光通量/单位面积。勒克斯的换算比较抽象，一般用烛光计算。现在把靠电力发光的光源记为国际烛光，即25瓦电灯的光强等于25个国际烛光。1标准烛光=10.76勒克斯。
植物组织培养中LED光源的选择
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光是植物生长最重要的环境因素之一，并不是所有的光都有助于植物的光合作用。LED光源的460nm蓝光和660nm红光是植物最需要的光波，对植物的生长发育起着关键作用。
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